弱化植物乳杆菌的选育及产酸性能分析

摘要: 以植物乳杆菌为研究对象，利用硫酸新霉素筛选压力，筛选获得三株 F1F0-ATPase 活 性 弱 化 突 变株 M04、M15 和 M20。产酸及耐酸性能分析表明：突变株 M04、M15 和 M20 的产 酸性能 弱 于 出发 株 ，其中 M20 的产 酸性能明显下降；在 pH5.5 和 4.5 的 MRS 液体培养基中 M20 的生长明显受到抑制；编码F1F0-ATPase 的 β 亚基 碱 基 序 列分析表明：三株突变株发生碱基突变而弱化 F1F0-ATPase 活 性 ，其中 突 变株 M20 在 多个位点 的 碱 基 置 换及 缺失对菌株的 F1F0-ATPase 活性影响较大。四川泡菜作为泡菜的典型代表， 以其独特的风味在国内外享有盛誉。
近年来，随着人们对乳酸菌生理功能认识的加强， 一些泡菜企业开始使用乳酸菌发酵剂生产富含乳酸菌的低盐泡菜。乳酸菌发酵剂的使用不仅可以解决蔬菜低盐腌制发酵过程中品质不稳定、亚硝酸盐含量标等关键技术问题，而且还可以缩短发酵周期，降低生产成本。但是，由于泡菜产品中乳酸菌含菌量高、活力强，使得发酵结束后，在泡菜贮存、运输和销售等食用前的过程中会发生后酸化， 出现消费者不可接受的过酸味。因此， 富含乳酸菌泡菜使用前的过酸成为了制约乳酸菌发酵剂生产低盐泡菜的主要问题。 植物乳杆菌是泡菜发酵中的优势菌种，具有较强的产酸能力和耐酸性，是泡菜发酵剂开发的优选菌株。当外界环境中的 pH 降低时， 植物乳杆菌质膜上的 F1F0-AT-Pase 能通过水解 ATP 提供能量将细胞内的质子泵出胞外，形成膜 pH 梯度差，维持胞内 pH 近中性，胞内代谢不受影响， 从而能够在低 pH 环境中能够继续生长和产酸。 这是导致富含乳酸菌泡菜过酸的主要原因。
乳酸菌 F1F0-ATPase 是一种跨膜蛋白酶复合物， 由胞外的 F1和嵌入细胞膜的 F0两部分构成。F1由 α、β、γ、δ 和 ε 五种亚基构成，F0由 a、b、c 三种亚基构成。的乳酸菌中都含有 F1F0-ATPase，它不仅可以调控乳酸菌胞内的 pH，还可以增强细胞的耐酸性，促进能量 ATP 转化。美国 Boyer 提出的“构象变化假说”认为：F1F0-ATPase 中 β 亚基构象的改变是影响酶活性的主要因素。Kanner 等研究表明： 低活性的 F1F0-ATPase 变异菌株对酸性环境非常敏感，当外环境 pH 值降到一定程度时，细胞内 H+的泵出效率降低，代谢受到影响，产酸能力下降。因此，在开发泡菜发酵剂时，筛选低活性 F1F0-ATPase的植物乳杆菌成为解决乳酸菌发酵剂生产泡菜中过酸问题的主要途径。基于此， 我们以泡菜发酵剂中的主要功能菌植物乳杆菌为研究对象， 从发酵剂生产的退化菌种中筛选弱化 F10-ATPase 的植物乳杆菌 ， 分析编码F1F0-ATPase 中 β 亚基的基因序列突变点或突变区域对菌株 F1F0-ATPase 活性的影响， 为开发富含乳酸菌的四川泡菜发酵剂提供优良植物乳杆菌菌株，以解决富含乳酸菌四川泡菜的过酸问题。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器
产酸退化植物乳杆菌和出发菌株 CCTCC 207202； 硫酸新霉素。TMQ.R-3250 型自动台式灭菌器；ZHWY-200D 型恒温培养振荡器；721 型分光光度计；PHS-3C 型 pH 计；T1-Thermoblock 型PCR 仪；DYY-8C 电泳仪；Gel Doc XR+凝胶成像分析系统。
1.2 方法
1.2.1 弱化 F1F0-ATPase 植物乳杆菌的筛选
吸取 100μL 活化培养的退化植物乳杆菌悬液，涂布于含 500μg/mL 新霉素的 MRS 固体培养基平板上， 同时吸取同样的菌悬液涂布于不含新霉素的MRS 固体培养基中，37℃培养 2-3d。
1.2.2 F1F0-ATPase 的 β 亚基编码序列的扩增及分析
采用 CTAB-SDS 方法分别提取突变株与出发株 CCTCC 207202 的总 DNA，PCR 扩增 F1F0-AT-Pase 的 β 亚基部分编码碱基序列 。 扩增引物 ：at-pDf：5′ -GTTGGTAARACYGTTTTAATT -3′ ；atpDr：5′-TCTTCRGAYAATTCATC-3′。 反应条件 ：95℃预变性 10min；95℃变性 1min，50℃退火 1min，72℃延伸 5min，35 个循环后 72℃延伸 10min。PCR 产物连接到 pGM-T 载体上 ， 转化 E.coliDH5α，提取重组质粒 DNA，测序。所得序列与出发株序列进行比较，探寻突变点。
1.2.3 耐酸性分析
分别用乳酸调节 MRS 液体培养基的 pH 值为5.5、4.5 和 3.5， 再分别将出发株 CCTCC 207202 与突变株按 1%的接种量接入上述液体 MRS 培养基中，37℃静置培养 24h，波长为 560nm 测定菌液的 OD 值，评估出发株 CCTCC 207202 与突变株的酸耐受特性。
1.2.4 产酸性分析
将活化好的突变株与出发株 CCTCC 207202 按1%的接种量接入 MRS 液体培养基中 ，37℃静置培养， 分别测定 12h，14h，16h，18h，20h，22h 和 24h 培养液的 pH 值。

2 结果与讨论
2.1 弱化 F1FATPase 菌株的筛选
利用新霉素作为筛选压力， 从产酸退化的植物乳杆菌中筛选弱化 F1F0-ATPase 菌株。500μg/mL 的新霉素 MRS 平板上的菌落数明显少于0μg/mL 新霉素的对照MRS 平板上的菌落。 这一结果表明 ： 植物乳杆菌CCTCC 207202 在生产或者保藏的过程中， 由于某些不利因素导致了某些菌株已经发生了产酸性能的退化。挑选MRS 平板上生长较好的菌落进一步纯化后得到编号为 M04、M15 和 M20 纯菌株做后续分析。
2.2 F1F0-ATPase 的 β 亚基编码序列分析
PCR 分别扩增出发株 CCTCC 207202 和突变株 M04、M15 和 M20 的 F1F0-ATPase 的 β 亚基编码序列，利用 ClustalX1.8 对齐。与出发株 CCTCC 207202 相比，3 株突变株在 F1F0-ATPase的 β 亚基的编码序列中的某些位点发生了突变。其中，M04 在 318 位点处的碱基由 C 置换为 T；M15 在194 位点处的碱基由 T 置换为 C；M20 在 165、423和 424 位点处的碱基分别由 T 置换为 C、 由 T 置换为 G、由 G 置换为 T，并且在 383 位点发生了碱基 A的缺失。
2.3 耐酸特性分析
为了进一步分析突变株 F1F0-ATPase 的 β 亚基编码序列的突变位点对菌株耐酸性能的影响， 将突变株 M04、M15 和 M20 以及出发株 CCTCC 207202按 1%的接种量接入 pH 为 5.5、4.5 和 3.5 的液体MRS 培养基中，37℃静置培养 24h， 波长为 560nm测定其 OD 值。当 MRS 培养基 pH 为 5.5 时，出发株 CCTCC 207202 与突变株 M04 和 M15 的生长无明显的差异， 而与突变株 M20 差异明显。 出发株CCTCC 207202 与突变株 M04 和 M15 在 pH 5.5 的MRS 液体培养基中培养 24h 后菌悬液 OD 值约1.63-1.72， 而 M20 菌悬液的 OD 值仅为 0.41。 当MRS 培养基 pH 为 4.5 时， 出发株 CCTCC 207202比其它突变株的酸适应力强， 比 M04、M15 和 M20生长快。 这主要是因为出发株 CCTCC 207202 的F1F0-ATPase 活性比突变株 M04、M15 和 M20 高，细胞膜磷脂双分子层对质子的通透性强， 能够有效的将胞内质子“泵”到胞外，保持胞内 pH 接近中性环境，所以耐酸性较强，生长快。对于突变株 M04、M15 和 M20， 由于编码 F1F0-ATPase 的 β 亚基的碱基突变差异， 其 F1F0-ATPase 的活性差异也有所不同， 因而在 pH 4.5 的 MRS 液体培养基中它们的生长速度也表现出了差异。 其中，M20 的 OD 值为0.16，M04 为 0.47，M15 为 0.44，CCTCC 207202 为0.76。然而，在 pH 为 3.5 的 MRS 液体培养基中时 ，由于环境 H+浓度出了 F1F0-ATPase 泵出能力，出发株 CCTCC 207202 和其它突变株皆表现出了较差的生长能力。
2.4 产酸性能分析
将活化后的菌株以 1%的接种量接种到 pH 7.0的MRS 液体培养基中，37℃静置培养， 测定不同时间段发酵液的 pH 值。随着培养时间增加，各菌株产酸逐渐趋于。培养12h 后 ， 出发株 CCTCC 207202 的 pH 值为 4.14，M04、M15 和 M20 分别为 4.25、4.37 和 6.28。而培养24h 后， 出发株 CCTCC 207202 的 pH 值为 3.62，而突变株 M04、M15 和 M20 分别为 3.63、3.61 和 3.96。在整个考察时间段，M20 与其它菌株在产酸方面表现差异比较大。为进一步评估 M20 与其它菌株产酸性能的差异，利用 SPSS13.0 对各个时间段产酸进行单因素方差分析。M20 在培养 12-24h内， 产酸明显区别于出发株 CCTCC 207202 和突变株 M04、M15，其平方差为 1.221-1.271。这主要是由于突变株 M20 的 F1F0-ATPase 活性低 ，ATP 的产量较少，胞内 H+不能及时泵出，整个细胞内酸的代谢受到影响， 在 12-24h 考察时间内表现出了耐酸性和产酸能力明显低于其它突变株 M04、M15 和出发株 CCTCC 207202。

3 结论
硫酸新霉素能够与细菌的 30S 核糖体亚基结合， 抑制细菌蛋白质的合成， 从而影响菌体的生长。新霉素的摄入是一个耗能过程，低活性的 F1F0-ATPase 突变株不能产生足够的能量，因此不受新霉素抗性的影响, 可以利用这一特性筛选出低活性的F1F0-ATPase 突变株。本实验利用新霉素为筛选压力， 从退化的植物乳杆菌中分别筛选到弱化 F1F0-ATPase 突 变 株 M04、M15 和 M20。 与 出 发 菌 株CCTCC 207202 相 比 ，M04、M15 和 M20 在 编 码F1F0-ATPase 的 β 亚基的碱基序列上发生了不同位点的突变。其中，β 亚基的编码序列 318 位点的碱基由 C 置换为 T 或 194 位点的碱基由 T 置换为 C 对F1F0-ATPase 的活性影响不大。该位点的突变株 M04和 M15 在 pH 5.5 的 MRS 培养基中没有与出发株CCTCC 207202 表现出明显的生长差异， 培养 24h后三株菌的 OD 值约为 1.65-1.70。 在 pH4.5 和pH 3.5 的 MRS 培 养 基 中 ，M04、M15 和 出 发 株CCTCC 207202 的生长尽管出现一定的差异， 但其生长量也没有显著性差异（图 3）。然而，突变株 M20在 pH 5.5-pH 4.5 的 MRS 液体培养基中生长量明显 区 别 于 突 变 株 M04、M15 和 出 发 株 CCTCC207202。这一结果表明：F1F0-ATPase 的 β 亚基编码序列的 165 位点由 T 置换为 C、423 位点由 T 置换为 G、424 位点由 G 置换为 T 和 383 位点 A 的缺失对 F1F0-ATPase 活性影响大。 产酸分析也表明：M20 的在培养 12-24h 内， 产酸明显区别于出发株CCTCC 207202 和突变株 M04 和 M15，其平方差为 1.221-1.271。这进一步说明 M20 的 F1F0-ATPase 的 β 亚基编码序列的突变位点对 F1F0-AT-Pase 影响大， 而 M04 和 M15 的突变位点对其活力的影响不大。直投式乳酸菌发酵剂是目前泡菜发酵技术的一个热点，它的应用将大地促进泡菜生产技术的发展。但是，泡菜是含活菌的发酵食品，在发酵剂发酵结束到食用前这一过程，菌体的继续生长和繁殖会使泡菜的 pH 下降， 出现消费者不可接受的过酸味。 利用乳酸菌自身的生理调节系统筛选弱化F1F0-ATPase 的乳酸菌是从根本上解决了泡菜过酸问题的主要手段。本研究中获得的弱化 F1F0-ATPase的植物乳杆菌 M20 菌株为开发富含乳酸菌的四川泡菜优良发酵剂提供了满意菌株，其研究思路和研究结果对推动四川泡菜产业发展具有一定的积意义。

来源：惠合冷热缸