植物和微生物合成 2-苯乙醇的研究进展
摘要: 2-苯乙醇是一种有广泛用途的香味物质，对其他香味在食品、烟草和化妆品等日化产品有增效作用。 介绍了目前 2-苯乙醇在植物和微生物中的代谢机理和最新研究进展，并对其研究前景进行了展望。
2-苯乙醇是一种具有类似玫瑰花香的挥发性无色液体。 自然界中 2-苯乙醇主要存在于裸子植物和被子植物及其提取的精油中。 国家 2-苯乙醇年产量近万吨，基本采用化学合成法生产。 2011 年 HuaDongliang 等提到化学合成的 2-苯乙醇国际市场价格为 5 美元/kg，近期未见关于天然 2-苯乙醇的市场价格的报道，2002 年其价格已高达 1 000 美元/kg以上。 单纯的植物提取法已无法满足人们对天然2-苯乙醇的需求，研究合成 2-苯乙醇产量较高的植物及微生物的代谢机理，提高 2-苯乙醇的产量已经成为研究热点。
1 植物转化合成
2-苯乙醇的研究现状目前对植物中 2-苯乙醇合成机制的研究尚处于起步阶段，且主要集中在美国、日本等国家。
1. 1 2-苯乙醇在番茄中的合成途径研究
Tieman 等通过同位素示踪法( 即用13C 标记苯丙氨酸) 确定了在番茄中 2-苯乙醇的合成途径:首先，AADC( 芳香族氨基酸脱羧酶) 催化苯丙氨酸转化为苯乙胺; 其次，MAO( 单胺氧化酶) 催化苯乙胺生成苯乙醛; 最后，经 PAＲ( 苯乙醛还原酶) 催化转化为 2-苯乙醇。 在整个反应过程中，关键酶包括AADC、MAO 和 PAＲ。 Tieman 等又确定了番茄里的两种酶: LePAＲ1 和 LePAＲ2。 他们将这两种酶的cDNA 分别在矮牵牛花中构建表达，发现转基因后的矮牵牛花中 2-苯乙醇的含量都有明显地提高。
1. 2 2-苯乙醇在玫瑰中的合成途径研究
Sakai 等发现在玫瑰花中由 L-苯丙氨酸合成2-苯乙醇有两个关键酶: 依赖 5-磷酸吡哆醛的AADC 和 PAＲ。 AADC 催化 L-苯丙氨酸合成苯乙醛是催化 D-苯丙氨酸的 9 倍，PAＲ 对多种挥发性醛类物质有专一性。 在有氧的情况下，AADC 在水解L-苯丙氨酸后，经过脱羧和氧化，生成了苯乙醛和 NH3，而后苯乙醛由 PAＲ 催化转化生成 2-苯乙醇，NADPH( 还原型辅酶Ⅱ) 和 NADH( 还原型辅酶Ⅰ) 都能在玫瑰中做 PAＲ 的辅助因子。
Chen Xiaomin 等对突厥蔷薇细胞内纯化的rose-PAＲ 和通过 cDNA 从大肠杆菌表达的重组 PAＲ做详细的研究，包括分子特性、专一性和对辅助因子的偏好性。 结果推断出来的重组氨基酸序列分别与番茄 PAＲ1 和 PAＲ2 有 77%和 75%相似性。 花瓣中PAＲ 含量要明显高于花萼和叶子，在花瓣展开的时候含量较高。 重组-PAＲ 和 rose-PAＲ 在催化苯乙醛合成 2-苯乙醇时更偏爱辅助因子 NADPH。 然而，rose-PAＲ 对苯乙醛的催化活性是重组 PAＲ 的 10倍，且它们的最适底物也不同，其原因可能是在大肠杆菌翻译后缺乏修饰作用。
虽然已有报道植物细胞合成 2-苯乙醇是通过莽草酸途径，并且通过同位素标记法知道苯乙醛是合成 2-苯乙醇过程中的前体和中间体，但有关植物合成 2-苯乙醇的完整途径的报道较少。 Yang Ziyin等采用化学合成稳定的［2，3，4，5，6 －13C5］莽草酸为前体物质，通过同位素标记法在离体并具有生物活性的玫瑰细胞原生质体上，推测出从莽草酸到2-苯乙醇在玫瑰细胞中的合成路径。
2 微生物转化合成
2-苯乙醇代谢途径的研究情况对微生物转化合成 2-苯乙醇的研究早已成熟，但目前一般都是通过艾氏途径调控 2-苯乙醇的合成。 艾氏途径是 L-苯丙氨酸通过转氨基作用生成苯丙酮酸，继而经过脱羧酶和氧化脱氢酶作用生成 2-苯乙醇。
3 国内外提高微生物产 2-苯乙醇的方法
2-苯乙醇对微生物的毒性是制约其高产量的关键因素，在其质量浓度为 2. 0 ～ 3. 0 g/L 时，能抑制多种细菌及真菌的生长。 为提高 2-苯乙醇产量，目前广泛采用的较为有效的方法有菌种的突变筛选，发酵培养基和发酵条件的优化以及原位萃取技术。
3. 1 菌种的突变筛选、发酵培养基及发酵条件优化
2008 年，崔志峰等通过对酿酒酵母用紫外诱变 等 方 法 进 行 诱 变 育 种，获 得 了 其 中 一 株CWY132210 菌株，其耐受性较原始菌株提高 50% ，产量提高了9. 1%。 2009 年 Eshkol 等选育出2-苯乙醇耐受性菌株，通过摇瓶发酵生产出4. 5 g/L 2-苯乙醇。 2010 年王航等从8 株酿酒酵母中初筛到一株菌株 FD0419，通过诱变和原生质体融合，最终筛得菌株 Ｒ-UV3. 2-苯乙醇产量达 2. 51 g·L－ 1，比出发菌株提高 69. 6%。 2013 年 Celińska 等第一次报道解脂耶罗维亚酵母具有产 2-苯乙醇的能力，并且在没有优化培养基的情况下发酵 Y。 lipolyticaNCYC3825，产 2-苯乙醇达 2 g / L。 2004 年 Etschmann等为提高 K。 marxianus CBS 600 产2-苯乙醇产量，采用遗传算法，通过改变 13 种培养基成分和培养温度，经过 98 次平行实验，最终生产2-苯乙醇质量浓度为 5. 6 g/L，较没优化前提高了 87. 0%。 2007年 Garavaglia 等以葡萄汁为培养基培养马克斯克鲁维酵母，通过 23 因子设计，得出在温度 37 ℃，pH值 7. 0，L-苯丙氨酸质量浓度为 3. 0 g/L 时，2-苯乙醇产率较高。 2007 年梅建凤等以 S。 cerevisiae BD为出发菌株，经响应面优化后，产物2-苯乙醇质量浓度可达4. 815 g/L。 2011 年 Ｒong Shaofeng 等选取可氧化降解乙醇的活性干酵母，以 L-苯丙氨酸为底物，以乙醇为碳源进行发酵生产 2-苯乙醇，发酵结束后产物 2-苯乙醇质量浓度可达到 2. 4 g/L。另外，优化的培养温度和 PH 值也能提高 2-苯乙醇的含量。
3. 2 原位萃取技术
2-苯乙醇像其他醇类物质一样对微生物细胞有一定的毒性，王航等研究了在不同浓度 2-苯乙醇作用下，酿酒酵母 Ｒ-UV3 生理生化特性的变化规律。 结果发现当 2-苯乙醇质量浓度从 2. 4 g/L 到3. 0 g / L 时，酵母的分解代谢能力、细胞膜渗透性、aro10 基因表达水平等生理生化特性都发生较为显著的变化。 所以在生产 2-苯乙醇过程中，须考虑2-苯乙醇的毒性，才能达到 2-苯乙醇高产的目的。为此，国内外研究人员采用了原位分离技术。
3. 2. 1 有机相－水相萃取技术
早期的研究都以油醇为有机萃取剂，如 Stark等在 2002 年以油醇作萃取剂，采用两相补料分批培养技术，发酵 S。 cerevisiae Giv2009，结果发现2-苯乙醇在油醇相中的含量达 24 g / L，总产量可达12. 6 g / L。 Etschmann 等在 2006 年用 K。 marxia-nus CBS600 发酵 2-苯乙醇，为消除终产物 2-苯乙醇对细胞生长的毒性，在培养过程中用聚丙二醇 1200作为提取剂，可使有机相中的 2-苯乙醇产量提高到26. 5 g / L。 梅建凤等研究了生物转化 2-苯乙醇在水/有机溶剂两相体系中合成工艺，实验结果说明，油酸是两相体系的萃取溶剂，但油酸可能会导致反应体系的溶氧降低，所以可以考虑在加入油酸的同时，适当的增加体系中的通氧速率。 同时，有机萃取有几个缺点:1) 萃取剂如油酸的沸点高，在 286 ℃( 100 mmHg) ，2-苯乙醇的沸点是220 ℃，在真空蒸馏时可能会发生反应;2) 萃取剂的香味会影响到产物的香气;3) 发酵产生的乳化液给产品的分离带来麻烦。
3. 2. 2 固相－水相吸附技术
虽然有机相 － 水相萃取技术效果明显，但是也伴随着黏度大、产品不易分离和毒性大等缺点，因此，有人采用固相－水相吸附技术从水相中吸附2-苯乙醇以提高其产量。 Mei Jianfeng 等用大孔吸附树脂 D101 吸附2-苯乙醇，最终产量达到6. 2 g/L，其中大孔树脂吸附量为 3. 0 g/L。 Hua Dongliang 等用大孔吸附树脂 HZ818，得到 6. 6 g/L 2-苯乙醇，摩尔转化率为 74. 4%，比没加入时提高了 66. 2%。 关昂等用大孔吸附树脂 FD0816 得到了 12. 8 g/L的 2-苯乙醇，较原先提高了 232%。 Wang Hang等采用原位分离技术显著提高了 2-苯乙醇的产率。 实验结果表明，大孔树脂 FD101 可以使2-苯乙醇的产率达到 20. 1 g/L。 Gao Fang 用 Hytrel8206( 热塑性聚酯) 得到 13. 7 g / L 的 2-苯乙醇，在这基础上采用半连续装置可使 2-苯乙醇产率达到20. 4 g / L，其中，1. 4 g / L 在水相，97. 0 g / L 在聚合物相中。 大孔树脂结构稳定，无挥发性气味，价格低廉，且在萃取过程中不会影响产品的质量，因此，在发酵体系中添加大孔树脂，能大大提高 2-苯乙醇的产率，在工艺路线中也简单易行，在工业生产天然2-苯乙醇中有良好的应用前景。
来源：惠合冷热缸
