农家泡菜发酵液中乳酸菌的研究
摘要: 对农家泡菜发酵液中乳酸菌含量和菌种进行分析研究，经倒平板计数检测出农家泡菜发酵液乳酸菌含量为 1.36×107cfu/mL；从农家泡菜发酵液中分离出 4 株乳酸菌菌株，经形态特征、菌落特征和生化特征分析，分别为植物乳杆菌、短乳杆菌、肠膜明串珠菌、戊糖片球菌。
农家泡菜以其营养丰富、味道鲜美、色泽光亮、制作简单而备受青睐。究其机理，是由于泡菜制作过程中乳酸菌发酵产生多种有益物质，降低发酵液中 pH 值，抑制蔬菜中有害菌，使泡菜颇具色香味美质。但农家常在食用泡菜后将发酵液倒掉，造成可循环利用的有益物质浪费。因此，分离鉴定泡菜发酵液中的乳酸菌，研究开发低成本、高质量、微生态的发酵剂和高效、绿色化的抑菌剂是变废为宝的一项重要课题。
1 材料与方法
1. 1 发酵材料与器具
白菜、黄瓜、青椒、苤蓝、胡萝卜、水、碘盐、调料 （花椒、大料、茴香、鲜姜、大蒜、大葱、红辣椒、桂皮、豆蔻、黄酒、白酒、红糖、食醋等）、泡菜坛。
1. 2 检测试剂与仪器
无菌水、改良 MC 培养基、结晶紫、酒精、过氧化氢溶液、葡萄糖发酵培养基、可溶性淀粉、PY基础培养基、卢哥氏碘液、石蕊牛乳、多种碳水化合物发酵物等主要试剂；移液管、三角瓶、洗瓶、试管、酒精灯、培养皿、接种杯、接种环、显微镜、比色盘、废液缸、载玻片、恒温培养箱、冰箱等仪器。
2 方 法
2. 1 农家泡菜的制作
2.1.1 制作流程
备菜→清洗→晾干→切分→装坛→加调料→注盐水→密封→发酵→成熟
2.1.2 操作要点
a） 备菜：备选新鲜、成熟、质厚、无蛀虫和腐烂现象的白菜、黄瓜、青椒、苤蓝、胡萝卜；
b） 清洗：剥除蔬菜表面废叶、切除头部、底部或根部后，用清水洗净；
c） 晾干：将蔬菜表面的水分晾干；
d） 切分：将蔬菜切成 3 cm ×3 cm 的小块；
e） 装坛：将切好的蔬菜放入泡菜坛,压实；
f） 加调料：把花椒、大料、茴香、鲜姜、大蒜、大葱、红辣椒、桂皮、豆蔻等调料配好，用卫生白纱布包扎好置于泡菜坛，黄酒、白酒、红糖、食醋等调料适量注入泡菜坛；
g） 注盐水：把 2 g/100mL～3 g/100mL比例的盐水注入泡菜坛, 至离坛口约 2 cm处；
h） 密封：泡菜坛中注满清水, 用坛盖密封；
i） 发酵：室温为 18 ℃左右，发酵时间为 5 d；
j） 成熟：发酵成熟后及时用于试验。
2.2 农家泡菜发酵液乳酸菌含量的测定
2.2.1 测定流程
泡菜发酵夜样品→稀释→倒平板→培养→检测计量
2.2.2 操作要点
a） 样品稀释：发酵成熟后，无菌操作从泡菜坛中吸取 1 mL泡菜发酵夜，移入装有 9 mL 灭菌生理盐水的试管中，振荡摇匀，然后再吸取 1 mL 稀释液按 10 倍稀释法递增稀释至 10- 5、10- 6、10- 7；
b） 倒平板：选择 10- 5、10- 6、10- 7稀释度，每个稀释度作 3 次重复，培养皿注明相应的标签，倒入溶化冷却至 45 ℃左右的改良 MC 培养基，置水平位置，迅速转动平皿使混合匀，冷却成平板；
c） 培养：将平皿倒置于 37 ℃恒温箱内培养48 h；
d） 检测计量：取出培养皿，观察长出的细小菌落，按常规方法选择 30～300 个菌落平皿进行计算。
3 乳酸菌菌种的分离鉴定
3.1 操作流程
乳酸菌菌种的分离→纯化→鉴定
3.2 操作要点
3.2.1 分离纯化
无菌条件下对平板中具有典型乳酸菌菌落特征的菌株进行反复划线分离，得到纯化的单菌落，将各菌株编号，供下一步检测分析使用。
3.2.2 菌种鉴定
首先将得到的纯化菌种进行革兰氏染色、过氧化氢酶和葡萄糖发酵试验, 其次对结果为革兰氏染色阳性、无芽孢、过氧化氢酶阴性、发酵葡萄糖产酸的菌种进行形态特征、菌落特征和生化特征检测分析,主要包括 H2S 试验、明胶液化试验、吲哚试验、淀粉水解试验、石蕊牛乳试验、碳水化合物发酵等试验，最后综合试验结果并对照 《伯杰细菌鉴定手册》 和 《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》 确定菌种名称。
a） 革兰氏染色：经涂片、晾干、固定、结晶紫染色、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、晾干程序后用油镜观察，深紫色为革兰氏染色阳性菌，红色为革兰氏染色阴性菌。
b） 过氧化氢酶试验：用接种环分别将菌落置于洁净试管内，滴加质量分数 3%过氧化氢溶液 2 mL，30 s 内有气泡者为阳性，无气泡者为阴性。
c） 葡萄糖发酵试验：将菌落穿刺接种于盛有葡萄糖发酵培养基的试管，37 ℃温箱中培养 24 h，如指示剂变黄，表示产酸，为阳性，不变或变蓝（紫） 为阴性。
d） 明胶水解试验：将菌落接种于明胶基础培养基中，37 ℃培养，并备一支未接种的试管作对照，共同置于冰箱中，等待对照管凝固后记录试验结果，反复观察对比多次，如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，凝固为阴性反应。
e） H2S 试验：吊一根乙酸铅滤纸条于接种管口，菌落经 48 h 室温培养，滤纸条变黑为阳性反应。
f） 吲哚试验：将供试菌株接种于产吲哚的培养液中，37 ℃培养 24 h，向试管中加入吲哚指示剂，观察结果。若培养液上层出现玫瑰红色，说明产生了吲哚，为阳性；若没有玫瑰红色出现，则向其中加入乙醚约 1 mL，震荡混匀，静置片刻，待乙醚浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入吲哚指示剂 10 滴，此时若乙醚层出现玫瑰红色，同样说明有吲哚产生，为阳性，反之为阴性。
g） 淀粉水解试验：将菌种接种于含有 0.5 g 可溶性淀粉的 PY 基础培养基中，取少许培养液于比色盘中，并备未接种的培养液作对照，分别在其中加入卢哥氏碘液，不显色表示淀粉水解，显蓝黑色或蓝紫色时，表示淀粉未水解或水解不完全。
h） 石蕊牛乳试验：牛乳中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，还原时则自上而下地褪色。
i） 碳水化合物发酵：将被分析菌种接种到含有待测定的糖或醇类碳水化合物的 PY基础培养基试管中，37 ℃培养 24 h，振荡培养。分析检测时取少量培养液于比色盘中，并备未加碳水化合物的 PY 培养液作对照，滴加试剂比较颜色的变化，记录产酸的强弱。
4 结果与分析
4.1 农家泡菜发酵液乳酸菌含量的测定
经倒平板计数检测出，农家泡菜发酵液乳酸菌含量为 1.36×107cfu/mL。
4.2 乳酸菌菌种的分离鉴定结果
经平板划线法对菌种的分离纯化，选取其中占优势的 4 株菌进行形态特征、菌落特征和生化特征的鉴定。
根据综上 4 株菌的形态特征、菌落特征、生化特征的试验结果，依据 《伯杰细菌鉴定手册》 和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，可鉴定 L1 为植物乳杆菌， L2 为短乳杆菌，L3 为肠膜明串珠菌，L4 为戊糖片球菌。
来源：惠合冷热缸
